La fluorescence est une émission lumineuse provoquée par l'excitation d'une molécule (généralement par absorption d'un photon) immédiatement suivie d'une émission spontanée. Fluorescence et phosphorescence sont deux formes différentes de luminescence. La fluorescence peut entre autres servir à caractériser un matériau.

Différences entre fluorescence et phosphorescence

Schéma fluorescence vs phosphorescence

Une molécule fluorescente (fluorophore ou fluorochrome) possède la propriété d'absorber de l'énergie lumineuse (lumière d'excitation) et de la restituer rapidement sous forme de lumière fluorescente (lumière d'émission). Une fois l'énergie du photon absorbée, la molécule se trouve alors généralement dans un état électroniquement excité, souvent un état singulet, que l'on note S0*. Le retour à l'état fondamental peut alors se faire de différentes manières : soit par fluorescence, soit par phosphorescence.

La fluorescence est caractérisée par l'émission d'un photon de manière très rapide. Cette rapidité s'explique par le fait que l'émission respecte une des règles de sélection de l'émission de photons de la mécanique quantique qui est ΔS=0, ce qui signifie que la molécule reste dans un état singulet.

La phosphorescence quant à elle est caractérisée par une transition d'un état S=0 vers un état S=1 (état triplet), qui n'est pas permise par le modèle quantique, mais qui est rendue possible par le couplage spin-orbite. Cependant, la transition est plus lente à s'effectuer. Suit alors une émission de photon pour retourner à l'état fondamental.

Généralités

La lumière ré-émise par la molécule excitée lors de la fluorescence peut être de même longueur d'onde (fluorescence de résonance) ou de longueur d'onde plus grande, voire parfois plus petite (absorption à deux photons). Dans les milieux liquides en particulier, le fait que la longueur d'onde d'émission après excitation soit plus grande provient du fait que la molécule retourne à l'état fondamental à partir du niveau de vibration le plus bas de l'état excité (règle de Kasha). Cette différence est appelée déplacement de Stokes.

Ce déplacement du spectre d'émission vers des longueurs d'onde plus élevées, décrit par le déplacement de Stokes, facilite grandement la séparation et la détection de la lumière de fluorescence, signal spécifique délivré par le fluorophore.

Il existe un grand choix de fluorochromes, chacun pouvant être caractérisé par ses spectres d'excitation et d'émission.

Le principe de fluorescence est utilisé, entre autres, dans les microscopes confocaux à balayage laser, les microscopes à fluorescence et les spectrofluoromètres.

Le phénomène de fluorescence ne se limite pas à l'émission dans le spectre visible, mais concerne toute la gamme du spectre électromagnétique, notamment l'émission de rayons X (fluorescence X).

Histoire

Aux environs de l'an 1000 existait chez l'empereur de Chine, un tableau magique sur lequel un bœuf apparaissait chaque soir. Ce fut le premier exemple, dans l'histoire, d'un matériau fabriqué par l'Homme, capable d'émettre de la lumière luminescente.

Ce procédé fut retrouvé par hasard par le cordonnier et alchimiste bolonais Vincenzo Cascariolo (1571-1624) en 1603

Le terme dérive du minéral fluorite qui a la particularité de présenter très fréquemment une fluorescence, mais aussi une triboluminescence, voire une thermoluminescence, sans être phosphorescente.

C'est Stokes qui invente le mot fluorescence en 1852. Il publie dans Philosophical Transactions of the Royal Society ses observations sur un phénomène qu'il propose de nommer fluorescence (à la place de réflexion dispersive), dans un article intitulé On the change of refrangibility of light. Le terme est introduit en 1853.

Fluorite

Adamite fluorescence verte et hémimorphite fluorescence bleu pâle

Calcite

Minéraux pouvant présenter une fluorescence

Adamite, albite, allophane, alunite, amblygonite, analcime, andalousite, anglésite, anhydrite, ankérite, anthophyllite, aragonite, autunite, bénitoïte, berlinite, calcite, célestine, cérusite, chamosite, charlesite, charoïte, colémanite, corindon, cristobalite, cryolite, danburite, datolite, diaspore, diopside, disthène, dolomite, épidote, érythrite, fluorite, fluorapatite, gypse, halite, haüyne, hémimorphite, heulandite, jadéite, laumontite, lussatite, manganaxinite, magnésio-axinite, magnésite, mélanophlogite, mellite, microcline natrolite, okénite, oligoclase, opale, pectolite, périclase, phlogopite, phosgenite, prehnite, quartz, rhodonite, scheelite, scolécite, smithsonite, sodalite, sphalérite, spinelle, spodumène, strontianite, thénardite, topaze, torbernite, trémolite, tridymite, uvarovite, variscite, wollastonite, wulfénite, zoïsite.

Dans le monde vivant

De nombreux cas de fluorescence s'observent dans la nature, ils sont généralement visibles sous lumière UV. De tels cas sont connus, entre autres, chez des champignons, des fruits comme les bananes, des végétaux contenant de la quinine comme Cinchona officinalis, des arthropodes comme les scorpions, des mammifères comme les Didelphidae...

Champignon fluorescent

sous UVA

Un scorpion sous lumière Ultraviolette apparaissant noir en lumière normale.

La quinine contenue dans certaines boissons gazeuses leur donne une fluorescence visible sous rayonnement ultraviolet.

Bananes sous lumière du jour et sous UV.

(en) Simone Moser en all, « Fluorescent chlorophyll catabolites in bananas light up blue halos of cell death », sur pnas.org,‎ juillet 2009

Caractéristiques des fluorophores

Les différentes caractéristiques des fluorophores sont :

Longueurs d'onde : celles qui correspondent aux pics des spectres d'excitation et d'émission,

Coefficient d'extinction (ou absorption molaire) : il relie la quantité de lumière absorbée, pour une longueur d'onde donnée, à la concentration du fluorophore en solution (M cm)

Rendement quantique : efficacité relative de la fluorescence comparée aux autres voies de désexcitation (= nombre de photons émis / nombre de photons absorbés)

Durée de vie à l'état excité : c'est la durée caractéristique pendant laquelle la molécule reste à l'état excité avant de retourner à son état basal (picoseconde). Cette durée est assimilable à la demi-vie de l'état excité.

Photoblanchiment (photobleaching) : lorsque la molécule est à l'état excité, il existe une certaine probabilité pour qu'elle participe à des réactions chimiques (on parle alors de réactions photochimiques), en particulier avec l'oxygène sous forme de radicaux libres. Le fluorochrome perd alors ses propriétés de fluorescence. Autrement dit, quand on excite une solution de molécules fluorescentes, une certaine proportion d'entre elles est détruite à chaque instant et par conséquent l'intensité de fluorescence décroît au cours du temps. Ce phénomène peut être gênant, notamment en microscopie de fluorescence, mais il peut également être mis à profit pour mesurer la mobilité moléculaire par la méthode de redistribution de fluorescence après photoblanchiment (FRAP) ou de FLIP (Perte de fluorescence au cours d'un photoblanchiment local).

Applications quotidiennes

Applications diverses

Beaux-arts : lumière noire et substances fluorescentes.

Du fait que la fluorescence se traduit généralement par l'émission de lumière visible à partir d'une source d'énergie invisible (ultraviolets), les objets fluorescents paraissent plus lumineux que des objets de même teinte, mais non fluorescents. Cette propriété est utilisée par les vêtements à haute visibilité et par les peintures anti-collision de couleur orange dont on peint, par exemple, certaines parties des avions, mais aussi dans un simple but esthétique (vêtements, etc.)

La fluorescence est également utilisée dans le cas de la lumière noire, source lumineuse composée essentiellement de proches ultra-violets, qui fait ressortir les blancs et les objets fluorescents lorsqu'elle est émise dans la pénombre, afin de créer une ambiance spéciale.

La fluorescence est aussi utilisée avec les rayons X

elle permet de convertir les rayons en lumière visible pour l'œil ou un capteur CCD, pour de l'imagerie, ou bien pour un photomultiplicateur (scintillateur utilisé en diffractométrie X ou en spectrométrie de fluorescence X) ;

elle permet de caractériser les matériaux, en spectrométrie de fluorescence X.

La fluorescence est également utilisée dans d'autres techniques d'imagerie médicales comme la tomographie optique diffuse ou ils permettent de récupérer les fluorures présents dans un tissu biologique.

Les surligneurs déposent sur le papier une encre fluorescente visible et résistante à la lumière sans pour autant masquer le texte lui-même.

La technique de détection du mercure ou du plomb par des fluoroionophores sélectifs est aussi une application de la fluorescence.

Tube fluorescent

Le tube fluorescent (nom officiel: tube luminescent) est une autre application bien connue. Ces tubes servent surtout à l'éclairage industriel et parfois domestique (appelés « néons » par erreur: car le gaz néon émet une lumière rouge). Ils contiennent des gaz, le plus souvent des vapeurs de mercure à basse pression ou de l'argon, qui émettent une lumière ultraviolette invisible lorsqu'ils sont ionisés. La paroi intérieure est recouverte d'un mélange de poudres fluorescentes, qui transforme cette lumière dans le domaine visible en s'approchant du blanc. Ces tubes offrent un bien meilleur rendement électrique qu'une lampe à incandescence classique, c'est-à-dire qu'ils émettent plus de lumens par watt consommé et, donc chauffent beaucoup moins. Aujourd'hui, la forme peut changer et l'électronique qui les contrôle permet un rendement encore amélioré. On trouve ainsi des lampes dites à économie d'énergie remplaçant avantageusement les lampes à incandescence classiques (toutefois leur recyclage en fin de vie est complexe et coûteux).

Utilisation

La chlorophylle a (comme tous les pigments) est fluorescente. La mesure de la fluorescence de la chlorophylle a (émise par une plante ou un organisme photosynthétique en général) est un puissant outil pour mesurer l'absorption de la lumière et le fonctionnement de la photosynthèse.

Certains bioessai, comme le Luminotox, utilisent la fluorescence photosynthétique comme une mesure indirecte de la toxicité sur un organisme photosynthétique. La baisse de fluorescence de la chlorophylle a étant un signe de la baisse de la photosynthèse et donc de l'effet d'un polluant sur l'organisme.

在白光(左)与紫外线(右)下的萤石

含有奎宁的通宁水在紫外线的照射下发出荧光

长颈瓶中不同尺寸的硒化镉(CdSe)量子点在紫外线的照射下发出荧光

荧光（fluorescence）是一种光致冷发光现象。当某种常温物质经某种波长的入射光（通常是紫外线或X射线）照射，吸收光能后进入激发态，并且立即退激发并发出出射光（通常波长比入射光的的波长长，在可见光波段）；而且一旦停止入射光，发光现象也随之立即消失。具有这种性质的出射光就被称之为荧光。一般以持续发光时间来分辨荧光或磷光，持续发光时间短于10秒的称为荧光，持续发光时间长于10秒的称为磷光。在日常生活中，人们通常广义地把各种微弱的光亮都称为荧光，而不去仔细追究和区分其发光原理。

荧光产生的微观机制

具有荧光性的分子吸收入射光的能量后，其中的电子从基态 （通常为自旋单重态）跃迁至具有相同自旋多重度的激发态 ，即 ，这里h = 普朗克常数 ， = 入射光光子的频率。处于激发态 的电子可以通过各种不同的途径释放其能量回到基态。比如电子可以从 经由非常快的（短于 秒）内转换过程无辐射跃迁至能量稍低并具有相同自旋多重度的激发态 ： ，紧接着从 以发光的方式释放出能量回到基态 ： ，这里发出的光就是荧光，其频率为 。由于激发态 的能量低于 ，故在这一过程中发出的荧光的频率 低于入射光的频率 。荧光态的寿命为 至 秒，这就是前面提到的＂立即＂退激发的具体含义。通常电子从激发态 跃迁至 的内转换过程非常的快，而且产生荧光的物质的分子可以通过所谓的振动弛豫过程很快地（约 秒）经由碰撞达到热平衡，这两个效应使得绝大部分荧光源自于振动基态 。总结产生荧光的反应过程为： 。 电子也可以从激发态 经由系间跨越过程无辐射跃迁至能量较低且具有不同自旋多重度的激发态 （通常为自旋三重态），再经由内转换过程无辐射跃迁至激发态 ，然后以发光的方式释放出能量而回到基态 。由于激发态 和基态 具有不同的自旋多重度，这一跃迁过程是被跃迁选择规则禁戒的，从而需要比释放荧光长的多的时间（从 秒到数分钟乃至数小时不等）来完成这个过程；而且与荧光过程不同，当停止入射光后，物质中还有相当数量的电子继续保持在亚稳态 上并持续发光直到所有的电子回到基态。这种缓慢释放的光被称为磷光。 以上提到的电子退激发的机制可以用Jablonski 图来表示。 荧光物质的量子效率定义为出射荧光光子数和入射光光子数的比。 此外，就发光细胞而言，萤光的产生是一种氧化反应，因此必须在有氧气的环境下方能进行。细菌细胞中会产生一种发光酵素（luciferase）及醛类发光基质，而经由氧气与能量物质的参与，共同反应而发出萤光；与萤火虫的发光反应很类似。只是二者不同之处在于能量的供应有所不同；萤火虫的发光能量来自三磷酸腺（ATP），而细菌的发光能量则来自黄素单核酸（FMNH2）。细菌发光的反应式如下。 由于醛类发光基质受到氧化，反应后成为一种酸类，且FMNH2亦氧化成为氧化态的FMN，因此这在化学反应上而言是一个氧化及释放能量的过程，而释放出的能量便是以发出萤光的形式表现出来。事实上，自然界中（尤其是海洋中）存在着许多发光细菌，但因这些细菌的分布不够密集，其微弱的发光现象便因亮度不够而被我们忽略了。而唯有当大量发光细菌聚集在一起共同发光时，才能形成我们肉眼可以观看到的发光现象。这也是为什么通常只在具有发光器的海洋动物中才观察到生物萤光的原因（发光器中聚集共生着高密度的发光细菌）。

自然界中的荧光现象

含有稀土元素的矿物萤石和方解石 极光也是高层大气中的萤光现象。 此外，萤火虫会利用自身一些发光细胞的生化反应，产生肉眼可见的萤光用来达到传达消息及求偶的目的。这种生物性的发光现象我们称之为「生物萤光」。在大自然中，除了萤火虫外，尚有许多其他生物可发出生物萤光，例如原生动物、真菌、甲壳类生物、昆虫、乌贼、水母、低等植物以及细菌等。这些发光的生物中有的是靠自身细胞的生化反应而发光，有些则是靠共生的细菌来发光。

荧光的应用

用于对DNA进行自动测序的链末端终止法：在原初的方法中，需要对DNA的引物端进行荧光标记，以便在测序凝胶板上确定DNA色带的位置。在改进的方法中，对作为链终止剂的４种双脱氧核苷酸（ddTBP）分别进行荧光标记，电泳结束后不同长度的DNA分子彼此分开，经紫外线照射，４种被标记的双脱氧核苷酸发出不同波长的荧光。通过分析荧光的光谱便可以分辨出DNA的串行。

DNA探测：溴化乙啶是一种荧光染料，当它在溶液中自由改变构型时，只能发出很弱的荧光；当它嵌入核酸双链的碱基对之间与DNA分子结合后，便可以发出很强的荧光。因此在凝胶电泳中，一般加入溴化乙啶对DNA染色。

DNA微阵列（生物芯片）：需要对基因组探针进行荧光标记，最后通过荧光信号确定靶标串行。

免疫学中的免疫荧光检查法：对抗体进行荧光标记，从而可以根据荧光的分布和形态确定抗原的部位和性质。

流式细胞仪（又称荧光激活细胞分选器，FACS） ：对样本细胞进行荧光标记，再用激光束激发使之产生特定的荧光，然后用光学系统检测并将信号传输到计算机进行分析，从而得到细胞相应的各种特性。

荧光技术还被应用于探测和分析DNA及蛋白质的分子结构，尤其是比较复杂的生物大分子。

水母发光蛋白最早是从海洋生物维多利亚多管发光水母中分离出来的。当它与Ca离子共存时，可以发出绿色的荧光。这一性质已经被应用于实时观察细胞内Ca离子的流动。水母发光蛋白的发现推动了人们进一步研究海洋水母并发现了绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein，GFP）。绿色荧光蛋白的多肽链中含有特殊的生色团结构，无需外加辅助因子或进行任何特殊处理，便可以在紫外线的照射下发出稳定的绿色荧光，作为生物分子或基因探针具有很大的优越性，所以绿色荧光蛋白及相关蛋白已经成为生物化学和细胞生物学研究的重要工具。

萤光显微成像技术：全内反射萤光显微镜

需要和荧光区分开来的几个概念

由光照（通常是紫外线或X射线）激发所引起的发光称为光致发光，例如荧光和磷光；由化学反应所引起的发光称为化学发光，例如演唱会上用的荧光棒是通过两种化学液体混合后发生化学反应发光的；由阴极射线（高能电子束流）所引起的发光称为阴极射线发光，电视机显现管的荧光屏发光就是阴极射线发光；生物体的冷发光现象是生物发光，比如萤火虫发出的光是“萤光”。 “萤”字在古汉语中与“荧”字通假；在部分华文地区，“萤”字使用在与昆虫有关者。荧光在**多称萤光；在中国大陆多称荧光，而“萤光”则通常是指萤火虫或其他生物的发出的光。